无缝克隆引物设计原则 引物设计原则
引物设计原则是：
1、引物长度一般为15-30bp，常用的为18-27bp，但不能大于38bp 。
2、引物GC含量一般为40%-60%，以45-55%为宜，上下游引物GC含量和Tm值要保持接近 。
3、引物所对应的模板序列的Tm值最好在72℃左右，至少要在55-80℃之间，Tm值曲线以选取72度附近为佳 ， 5'到 3’的下降形状也有利于引物与模板的结合 。
4、ΔG值（自由能）反应了引物与模板结合的强弱程度，3'端的ΔG值相对要低，且绝对值不要超过9，否则不利于正确引发反应，3'末端双链的ΔG值在0--2kcal/mol时，PCR产量几乎达到百分之百 ， 但在-6时只达到40%，-8时少于20% ， -10时接近于0 。
【无缝克隆引物设计原则 引物设计原则】
5、错配率一般不要超过100，否则会出现非目的条带 。但对于某些特定的模板序列 ， 还应结合比较其在正确位点的引发效率 。如果两者相差很大 ， 比如在正确位点的引发效率为340以上 ， 而在错误位点的引发效率为110，并且不好找到其他更合适的引物 ， 那么这对引物是可以接受的 。
6、Frq曲线为Oligo6软件新引进的一个指标 ， 解释了序列片段存在的重复几率大?。∪∫锸?nbsp;， 应该用Frq值相对较低的片段 。
7、引物二聚体及发卡结构的能量的绝对值一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体而且会降低引物浓度从而导致PCR不能正常发生 。
8、3'端最好不要是连续碱基，GGG或CCC会导致错误的引发，同时3'端最后一个碱基最好不要是A或T ， 若是，会导致错配 。
9、以公式Tm=4*（G+C）+2*（A+T）-5计算Tm值，也就是退火温度 。选择较低Tm值的引物的退火温度为反应的退火温度 ， 最好保证每个引物的Tm值相匹配 ， 且在70-75℃范围内 。
10、模板与稳定性较小的引物之间的Tm的差异越小，PCR的效率越高 。因为解链温度也取决于它的长度，如果期待的产物长度等于或小于500bp，选用端的引物（16-18bp），如果产物长5kb，则用24bp的引物 。
11、在DNA测序和PCR中最好用5'末端稳定（GC含量多），而3'端不稳定（AT含量多）的引物，这种引物的结构可以有效地消除假引发反应 。
12、引物和产物之间的Tm值相差别太大，20摄氏度范围内最好 。
13、对引物的修饰一般在5'端进行，例如加酶切位点，加酶切位点的同时要根据需要添加保护碱基 。
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